张鹍教授PNAS又一力作！单细胞测序的”CPU 20”时代

　　对单个人类细胞的基因组进行准确的变异检测和大范围单倍体型分析一直以来都是测序领域的巅峰挑战。单细胞测序使我们能在更高的分辨率下研究生命的机制。一方面，在像癌症这样的组织样本中存在大量具有不同基因组类型的单个细胞,因此需要分析单细胞水平基因组而不是大量细胞的平均值；另一方面，对于非常珍贵的细胞样品，如人类卵母细胞和循环肿瘤细胞（CTCs），单细胞测序具有无与伦比的优势；此外，利用单细胞测序，还可以揭示细胞个体在特定时间的演化情况。

　　正常人类单个细胞DNA含量为6.6pg，相对于测序所需的ug级相当微量，并且独一无二，“有些DNA一旦错过就不再”！因此单细胞测序的关键一环是全基因组扩增(WGA)，常见的方法如，DOP-PCR、MDA、MALBAC等需要用DNA聚合酶对细胞基因组做大量的体外扩增，然后构建文库进行相对读长较短的高通量测序。这些方法有两个明显的缺点：1，聚合酶的错误扩增可以在基因组上产生成千上万的假阳性。2，短的序列读长几乎不包含任何单倍体类型信息。

　　该方法是利用微流体处理器将单个细胞染色体DNA的正负双链进行分离，并将百万碱基大小的DNA片段随机分割成大量的纳升级的组分，用于扩增和构建测序文库，从而实现对同源染色体的互补双链分别进行独立的测序。这样就能够进行Long-range单倍体的组装，并且还能利用冗余和单倍体型信息纠正测序错误。据文章结果显示，该方法的纠错能力可以将单细胞测序错误率降低至10-8，并且单倍体片段平均可组装长度为500kb，重叠群contig达到N50大于7 Mb。该方法性能可以进一步提高，使其扩增更均匀和比对更精确，能够获得精准的单细胞基因组序列以及单倍体信息以满足临床对基因组测序的不同需求。

　　微流体反应器应用于单细胞测序其实早有应用，黄岩谊和谢晓亮教授为了精确检测基因组变异，在2015年报道的emulsion WGA (eWGA)技术即是“emulsion+MDA+microfluidic Chip”的三位一体的结合，无论是扩增的均匀性、基因组的覆盖度还是假阳性的比例都有明显的改善。如果说eWGA是单细胞测序的“CPU 1.0”，那么张鹍教授的方法进行了巧妙的改进，将其升级到了2.0时代。

　　2，将大片段通过均匀分布到24个独立的反应小室中，分别扩增建库。这好比是做拼图游戏，将整个240块图形，先区分成24个区域，每个区域做10个图形的拼凑，大大降低了组装难度，并且Mb级别的大片段包含了大量单倍体型的信息；另外独立小室的MDA反应体系更接近单分子扩增，同于eWGA的效果，能使扩增均匀性得到大大提升。

　　图: eWGA：在一个试管中，裂解单个细胞，然后与MDA反应缓冲液混合。用于微流体交叉连接装置的乳化生成均匀分布的微滴，进行DNA片段扩增（来源文献3）。

　　图: SISSOR技术：单细胞捕获，进行裂解，染色体DNA分子以KOH溶液(ALS)分离成单链形态。单股DNA分子在24个小室随机分布。每个小室都被放入MDA反应室。每小室里的扩增分别收集出来，然后加工成单独barcode的测序文库。

　　1. 单倍体组装：通过将所有reads比对到参考基因组序列，能够达到预期的将Mb级DNA片段可视化的呈现，并且能够将两条同源的姐妹单体上四条互补链区分开来。

　　2. 提高测序精度：基于SISSOR的单链独立小室的实验基础，可以通过比较不同小室的单链碎片的单倍体类型来确定互补链，并将不同小室的同源序列相互匹配来纠正测序错误比率。

　　论文通讯作者张鹍教授表示，SISSOR是对单细胞测序技术的一次突破，将测序准确性提高了两个数量级。

　　对于SISSOR技术的应用前景，张鹍教授介绍道：“这项技术潜在的应用包括对患者血液中循环肿瘤细胞进行准确的检测，以及对体外受精的健康胚胎进行筛选，此外，利用该技术可以对经过基因组编辑的人体细胞进行检测，以达到治疗的目的。”

　　随着前不久“人类细胞图谱”计划的开展，单细胞测序的研究热情必然持续高涨，SISSOR技术凭着其独特的单倍体型分析优势，和超高的测序精度必然将成为人们争相使用的技术。希望通过不断的完善，为科研和临床做出更大贡献。

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